Лаборатория генетики стволовых клеток

Изучение функциональной активности CFTR канала под действием CFTR модуляторов

В лаборатории генетики стволовых клеток совместно с Molecular cystic fibrosis laboratory of the University Medical Center Utrecht, Нидерланды внедрен в медицинскую практику форсколиновый тест на культуре кишечных органоидов, полученных из ректальных биоптатов пациентов. Тест основан на получении органоидов из биопсийного материала кишечника пациента, позволяет осуществить подбор таргетной терапии CFTR-модуляторами и оценить эффективность зарегистрированных препаратов для лечения больных муковисцидозом с мутациями гена CFTR, не включенных в формуляр лекарственного средства. Совместно с Научно-клиническим отделом муковисцидоза МГНЦ проводится комплексное изучение патогенности редких, не описанных ранее мутаций, эндемичных для РФ. Впервые изучена патогенность редких, не описанных ранее мутаций V1421E, c.3274T>C, W227X, c.1083G>A, CFTRdel1-11, E403D, c.1584+18672A>G,с.1513A, L732X, G1047S, c.1766+2T>C, С.264_268del, T1036N.

Создан и непрерывно пополняется криобанк кишечных органоидов с уникальными мутациями в гене CFTR. Все образцы кишечных органоидов хранятся в ЦКП «Биобанк» ФГБНУ «МГНЦ».

Исследование механизма паракринного действия нейральных клеток человека при лечении неврологических заболеваний

В лаборатории генетики стволовых клеток в моделях нейродегенеративных заболеваний проводятся работы по изучению механизма терапевтического действия секретируемых нейральными клетками человека белков и везикул.

Создана технологическая платформа получения ноотропных препаратов на основе белково-пептидных комплексов и терапевтических экзосом, полученных путем направленной дифференцировки в нейральном направлении индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (иПСК).

Разработан лабораторный регламент получения ноотропного препарата состоящий из протоколов: забора кожи у пациентов, получения культуры дермальных фибробластов, получения иПСК из культуры дермальных фибробластов, отбора клонов иПСК, дифференцировки иПСК в нейрональные стволовые клетки (НСК), дифференцировки НСК в нейрональные и глиальные предшественники (НП и ГП), получения кондиционированных сред от НП и ГП, очистки кондиционированной среды от клеточного дебриса и нуклеиновых кислот, выделения из кондиционированной среды белково-пептидного комплекса с молекулярной массой от 5 до 100 кДа в фармакопейном буфере

Показано в моделях in vitro:

- протективное действие белково-пептидного комплекса, выраженное в уменьшении количества апоптотических и некротических клеток в первичной культуре мозжечковых нейронов в модели глутаматной эксайтотоксичности и клеточной линии нейробластомы SH-SY5Y при гипоксии. Действие белково-пептидного комплекса приводит к подавлению экспрессии гена Bax и увеличению экспрессии гена Bcl2 в культуре мозжечковых нейронов и клеток нейробластомы линии SH-SY5Y;

- нейротрофическое действие белково-пептидного комплекса, которое приводит к восстановлению и росту аксонов и дендритов мозжечковых нейронов и клеток нейробластомы линии SH-SY5Y, увеличивая экспрессию маркеров нейритогенеза Map2 и Gap43

Показано в модели in vivo:

Внутриартериальное введение белково-пептидного комплекса, полученного из кондиционированной среды глиальных предшественников в модели острой фокальной ишемии головного мозга крыс приводит к снижению проявлений неврологического дефицита, уменьшению экспрессии генов провоспалительного цитокина Tnfa и увеличению экспрессии противовоспалительных цитокинов Il4, Il10, Il13, снижению количества клеток микроглии/макрофагов в зоне повреждения головного мозга крыс.

Создание новых ген-активированных остеопластических материалов

Ещё одним направлением научной деятельности лаборатории является изучение способов индукции и регуляции дифференцировки прогениторных клеток в остеогенном направлении с использованием остеоиндуктивных факторов семейства BMP (bone morphogenetic proteins), плазмидных конструкций и вирусных векторов, несущих ген BMP-2, а также микроРНК, блокирующих гены ингибиторов остеогенеза, с целью создания новых терапевтических подходов для обеспечения репаративного остеогенеза.

Для иммобилизации белковых факторов и генетических конструкций использовали резорбируемые матрицы из полимеров природного и синтетического происхождения; различных по структуре - в виде жестких пористых каркасов, губчатых материалов, гелеобразных форм; полученных методами вспенивания, криосублимации, сверхкритических флюидных технологий, поверхностно-селективного лазерного спекания, гелизации, 3D-принтинга и других.  Используемые методы получения матриц позволили включать остеоиндуктивные факторы и генетические векторы непосредственно в структуру материала, обеспечивая сохранность их биологических свойств и пролонгированное высвобождение в соответствии с этапами физиологической регенерации, что существенно повышало эффективность применения таких материалов.

Лаборатория генетики стволовых клеток участвует в выполнении мультидисциплинарных научных проектов, поддержанных грантами РНФ и Минобрнауки РФ, в сотрудничестве с научными коллективами НИЦ «Курчатовский институт», ФГБУ «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии» Минздрава России, ФНИЦ «Кристаллография и фотоника» РАН, НИИ морфологии человека и другими.

По материалам исследований лаборатории защищено 15 кандидатских и 5 докторских диссертаций.

1. Vasilyev, A.V.; Kuznetsova, V.S.; Bukharova, T.B.; Osidak, E.O.; Grigoriev, T.E.; Zagoskin, Y.D.; Nedorubova, I.A.; Domogatsky, S.P.; Babichenko, I.I.; Zorina, O.A.; Kutsev, S.I.; Chvalun, S.N.; Kulakov, A.A.; Losev, F.F.; Goldshtein, D.V. Osteoinductive Moldable and Curable Bone Substitutes Based on Collagen, BMP-2 and Highly Porous Polylactide Granules, or a Mix of HAP/β-TCP. Polymers 2021, 13, 3974. https://doi.org/10.3390/polym13223974
2. Salikhova D., Bukharova T., Leonov G., Bulatenco N., Mokrousova V., Nikitina M., Elchaninov A., Midiber K., Mikhaleva L., Fatkhudinov T., Cherkashova E., Namestnikova D., Gubskiy I., Makarov A., Chekhonin V., Akopyan G., Yarygin K., Goldshtein D.,  Therapeutic effects of hipsc-derived glial and neuronal progenitor cells-conditioned medium in experimental ischemic stroke in rats. International Journal of Molecular Sciences. 2021. Т. 22. № 9.
3. Kondratyeva E., Bukharova T., Efremova A., Melyanovskaya Y., Bulatenko N., Davydenko K., Filatova A., Skoblov M., Krasovsky S., Petrova N., Polyakov A., Adyan T., Amelina E., Zhekaite E., Zodbinova A., Chernyak A., Zinchenko R., Kutsev S., Goldshtein D., Shadrina V. Health characteristics of patients with cystic fibrosis whose genotype includes a variant of the nucleotide sequence c.3140‐16t>a and functional analysis of this variant.  Genes. 2021. Т. 12. № 6. С. 837.
4. Kondratyeva E., Efremova A., Melyanovskaya Y., Petrova N., Bulatenko N., Bukharova T., Zodbinova A., Sherman V., Kashirskaya N., Zinchenko R., Kutsev S., Goldshtein D., Satsuk N. Clinical and genetic characterization of patients with cystic fibrosis and functional assessment of the chloride channel with the pathogenic variant c.831g>a (p.trp277*), described for the first time. GENE. 2020. Т. 761. С. 145023.
5. Elchaninov A., Fatkhudinov T., Makarov A., Vorobieva I., Lokhonina A., Usman N., Vishnyakova P., Sukhikh G., Glinkina V., Kananykhina E., Nikitina M., Bolshakova G., Goldshtein D. Inherent control of hepatocyte proliferation after subtotal liver resection. Cell Biology International. 2020. Т. 44. № 1. С. 80-88.
6. Kondratyeva E., Melyanovskaya Y., Efremova A., Bulatenko N., Bukharova T., Petrova N., Zodbinova A., Sherman V., Kashirskaya N., Ledneva V., Ulyanova L., Zinchenko R., Goldshtein D., Kutsev S. P009 clinical and genetic characteristics of cystic fibrosis patients carrying pathogenic variant c.1083g> a (p.trp361*). Journal of Cystic Fibrosis. 2020. Т. 19. № S2. С. S57.
7. Vasilyev A.V., Kuznetsova V.S., Korolenkova M.V., Zorina O.A., Kulakov A.A., Bukharova T.B., Goldshtein D.V., Grigoriev T.E., Zagoskin Y., Chvalun S.N. Development prospects of curable osteoplastic materials in dentistry and maxillofacial surgery. Heliyon. 2020. Т. 6. № 8. С. e04686.
8. Efremova A., Kashirskaya N., Bukharova T., Bulatenko N., Petrova N., Zhekaite E., Kondratyeva E., Zinchenko R., Goldshtein D., Kutsev S. Ws13-5 the investigation of vx-809 and vx-770 effects on cftr channel function in c.[4262t>a];[1521_1523delctt] (v1421e/f508del) genotype using an intestinal organoid culture. Journal of Cystic Fibrosis. 2019. Т. 18. № S1. С. S25.
9. Arutyunyan I., Fatkhudinov T., Elchaninov A., Makarov A., Usman N., Kananykhina E., Lokhonina A., Sukhikh G., Vasyukova O., Bolshakova G., Goldshtein D. Umbilical cord-derived mesenchymal stromal/stem cells enhance recovery of surgically induced skeletal muscle ischemia in a rat model. Histology and Histopathology. 2019. Т. 34. № 5. С. 513-523.
10. Lokhonina A.V., Elchaninov A.V., Fatkhudinov T.Kh., Makarov A.V., Arutyunyan I.V., Grinberg M.V., Glinkina V.V., Surovtsev V., Bolshakova G.B., Goldshtein D.V., Sukhikh G.T. Activated macrophages of monocytic origin predominantly express proinflammatory cytokine genes, whereas kupffer cells predominantly express anti-inflammatory cytokine genes. BioMed Research International. 2019. Т. 2019. С. 3912142.
11. Elchaninov A.V., Fatkhudinov T.K., Usman N.Y., Kananykhina E.Y., Arutyunyan I.V., Makarov A.V., Lokhonina A.V., Sukhikh G.T., Bolshakova G.B., Glinkina V.V., Eremina I.Z., Surovtsev V.V., Goldshtein D.V. Dynamics of macrophage populations of the liver after subtotal hepatectomy in rats. BMC Immunology. 2018. Т. 19. С. 23.
12. Grigoriev T.E., Bukharova T.B., Vasilyev A.V., Leonov G.E., Zagoski Y.D., Kuznetsova V.S., Gomzyak V.I., Salikhova D.I., Galitsyna E.V., Makhnac O.V., Tokaev K.V., Chvalun S.N., Goldshtein D.V., Kulakov A.A., Paltsev M.A. Effect of molecular characteristics and morphology on mechanical performance and biocompatibility of pla-based spongious scaffolds. BioNanoScience. 2018. Т. 8. № 4. С. 977-983.
13. Elchaninov A., Fatkhudinov T., Usman N., Arutyunyan I., Makarov A., Lokhonina A., Sukhikh G., Eremina I., Surovtsev V., Bolshakova G., Glinkina V., Goldshtein D. Multipotent stromal cells stimulate liver regeneration by influencing the macrophage polarization in rat. World Journal of Hepatology. 2018. Т. 10. № 2. С. 287-296.
14. Arutyunyan I., Fatkhudinov T., Kananykhina E., Usman N., Elchaninov A., Makarov A., Bolshakova G., Sukhikh G., Goldshtein D. Role of vegf-a in angiogenesis promoted by umbilical cord-derived mesenchymal stromal/stem cells: in vitro study. Stem Cell Research and Therapy. 2016. Т. 7. № 1. С. 46.