Выполнение проекта по Соглашению о предоставлении субсидии №14.604.21.0184 от «26» сентября 2017 г.

Выполнение проекта по Соглашению о предоставлении субсидии №14.604.21.0184 от «26» сентября 2017 г. с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» по теме: «Разработка персонализированного ноотропного препарата, полученного на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека»

На этапе № 1 проекта в период с 26.09.2017 г. по 31.12.2017 проведены следующие работы:

1. Выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему разработки ноотропного препарата на основе нейрональных клеток человека, исследуемую в рамках ПНИ.
2. Создана материально-техническая база для выполнения ПНИ.
3. Проведены патентные исследования в соответствии ГОСТ Р 15.011-96.
4. Разработан предварительный протокол получения белково-пептидного комплекса на модельной системе фибробластов человека.
5. Разработан протокол культивирования и протокола криоконсервации ИПСК человека. Получено необходимое количество и криоконсервированы культуры ИПСК человека в xeno-free условиях для нейрональной дифференцировки (2,5 млрд клеток)
6. Разработан протокол получения ИПСК человека. Получены и охарактеризованы первичные культуры ИПСК из соматических клеток человека (не менее 2 клонов от 5 различных доноров).
7. Получены культуры фибробластов человека для разработки предварительного протокола получения белково-пептидного комплекса.

На данном этапе обоснованы и выбраны направления исследований и разработок. Был отработан метод лизиса фибробластов человека и изучен состав компонентов белково-пептидного комплекса фибробластов при их фракционировании методом ионообменной хроматографии. На основе полученных результатов был разработан предварительный протокол получения белково-пептидного комплекса на модельной системе фибробластов человека. Разработан протокол получения ИПСК человека. Получены и охарактеризованы первичные культуры ИПСК из соматических клеток человека. Плюрипотентность 10 клонов ИПСК человека, полученных от 5 доноров, была подтверждена на молекулярном и на функциональном уровнях. Было показано, что все 10 клонов ИПСК экспрессируют гены плюрипотентности.

В результате проведенной работы были подобраны оптимальные условия для культивирования и криоконсервации культур ИПСК человека, что позволило увеличить выживаемость клеток после размораживания до 90%. На культурах фибробластов человека проведен комплекс исследований по разработке предварительного протокола получения белково-пептидного комплекса.

В результате реализации Проекта будут разработаны экспериментальные и технологические подходы для создания ноотропного лекарственного препарата нового поколения. Разрабатываемый инновационный ноотропный препарат отвечает направлению дорожной карты «Биомедицина» и «Здоровое долголетие» Хелснет Национальной технологической инициативы и влияет на контрольные показатели реализации дорожной карты - доли персонализированных лекарственных средств и биомедицинских клеточных продуктов с полным циклом производства в Российской Федерации.

Предлагаемые решения по разработке ноотропного препарата предлагаются впервые.

Полученные результаты соответствуют требованиям к выполняемому проекту.

На этапе № 2 проекта в период с 01.01.2018 г. по 31.12.2018 проведены следующие работы: 

1. Разработан протокол нейральной дифференцировки ИПСК человека. Проведена стандартизация получаемых нейрональных/глиальных культур.
2. Проведена морфологическая и иммуноцитохимическая характеристика культур нейрональных/глиальных клеток.
3. Проведена оценка профиля экспрессии ключевых маркеров нейрогенеза.
4. Разработан протокол получения белково-пептидного комплекса из культур нейрональных/глиальных клеток человека. 
5. Получены экспериментальные образцы белково-пептидного комплекса из культур нейрональных/глиальных клеток человека
6. Разработан лабораторный регламент получения прототипа ноотропного препарата на основе белково-пептидного комплекса из культур нейрональных/ глиальных клеток человека.
7. Исследован профиль экспрессии генов маркеров нейрогенеза методом ПЦР в режиме реального времени. 
8. Проведено наращивание и криоконсервация культур ИПСК человека в xeno-free условиях для нейрональной дифференцировки (3,5 млрд клеток)
9. Проведена молекулярно-генетическая характеристика культур клеток путем транскриптомного анализа.
10. Охарактеризован качественный и количественный состав белково-пептидного комплекса
11. Разработан протокол контроля качества клеточных культур на этапах получения ИПСК человека и нейрональных/глиальных клеток
12. Проведена оценка нейропротекторного и нейротрофического действия экспериментальных образцов белково-пептидного комплекса in vitro
13. Получены экспериментальные образцыв культур нейрональных/ глиальных клеток человека для получения белково-пептидных комплексов
14. Разработаны условия хранения, упаковки, транспортировки прототипа ноотропного препарата
15. Подготовлены 2 заявки на патент. 

На данном этапе проекта разработан протокол нейральной дифференцировки ИПСК человека в 3D системе с использованием на первом этапе малых молекул LDN193189, SB431542, дорсоморфина, на втором этапе -  фактора роста FGF-2 и пурморфомина, а на третьем - нейротрофического фактора BDNF. Нейральные стволовые клетки (НСК) представляли собой мелкие клетки, идентичные по морфологии клеткам нейроэпителия нервной трубки и экспрессировали маркеры PAX6, Nestin, SOX2 и FOXP2. Тела зрелых нейронов и астроглии имели отросчатую форму и иммуноцитохимически окрашивались на TUBB3, MAP2 и GFAP, соответственно. Методом ПЦР в режиме реального времени показан высокий профиль экспрессии SOX2, PAX6, FOXP2, Nestin, TUBB3 при нейральной дифференцировке. С помощью транскриптомного анализа выявлена активация сигнальных путей, задействованных в процессе нейрогенеза в период эмбрионального развития. Путем протеомного анализа исследован белковый состав клеточных лизатов, полученных из клеток на разных стадиях нейральной дифференцировки.  

Выбран оптимальный способ экстрагирования белка из клеточных культур, основанный на лизисе в буфере Tris-HCl и низкоскоростном центрифугировании, позволяющий получить белково-пептидный комплекс, содержащий 60±2,7 пг/мл BDNF, 46,5±11,2 пг/мл NT-4, 38,61±1,04 пг/мл NGF из 2,5 миллионов клеток. Хранение белково-пептидного комплекса рекомендовано при -20°С. В результате хроматографического разделения белково-пептидного комплекса получена фракция отрицательно-заряженных белков, очищенная от нуклеиновых кислот. 

В результате проведенного исследования in vitro в модели глутаматной токсичности на культуре мозжечковых нейронов крыс и на культуре PC-12 было подтверждено, что БПК из нейронально/глиальных клеток, полученный по разработанному в ходе проекта протоколу, способен оказывать нейропротекторное и нейротрофическое действие, превосходящее по эффективности действие коммерческого препарата «Церебролизин».

Полученные данные о способе получения и составе белково-пептидного комплекса позволили подготовить две заявки на патент:
Заявка на изобретение №2018118201 от 17.05.2018 «Способ получения ноотропной композиции на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейронов и глиальных клеток, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека», РФ.

Заявка на изобретение №2018118199 от 17.05.2018 «Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейронов и глиальных клеток, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека».

Полученные результаты соответствуют требованиям к выполняемому проекту. 

На этапе № 3 проекта в период с 01.01.2019 по 31.12.2019 проведены следующие работы: 

1. Получены экспериментальные образцы прототипа ноотропного препарата на основе белково-пептидного комплекса для экспериментальных исследований;
2. Разработаны протоколы экспериментального исследования эффективности культуры нейрональных/глиальных клеток, белково-пептидного комплекса из культур нейрональных/глиальных клеток человека и прототипа ноотропного препарата на основе белково-пептидного комплекса in vivo на модели острой фокальной ишемии головного мозга у крыс методом транзиентной окклюзии средней мозговой артерии;
3. Исследованы терапевтические эффекты экспериментальных образцов прототипа ноотропного препарата на основе белково-пептидного комплекса на модели транзиентной окклюзии средней мозговой артерии 90 мин;
4. Исследованы терапевтические эффекты экспериментальных образцов культур нейрональных/глиальных стволовых клеток после системной трансплантации крысам в модели транзиентной окклюзии средней мозговой артерии 90 мин;
5. Проведена оценка очага инфаркта мозга и других церебральных изменений с помощью магнитно-резонансной томографии, неврологического дефицита, массы и выживаемости животных в динамике;
6. Проведено обобщение результатов ПНИ, проверка их соответствия требованиям ТЗ, оценка результативности ПНИ и эффективности результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем;
7. Подготовлены предложения и рекомендации по реализации (коммерциализации) результатов ПНИ, вовлечению их в хозяйственный оборот;
8. Разработан проект ТЗ на ПНИЭР Доклиническое исследование разработанного ноотропного препарата.
9. Подготовлены 3 заявки на патент. 

На 3 этапе проводились исследования по изучению эффектов внутриартериальной и внутривенной трансплантации ИПСК-НПК. Результаты показали, что в обоих случаях системного введения клетки оказывают положительное терапевтическое воздействие на течение экспериментального ишемического инсульта у крыс. Системная трансплантация достоверно улучшала выживаемость лабораторных животных и набор массы тела в острейшем периоде инсульта. Также происходило ускорение уменьшения выраженности неврологического дефицита животных по сравнению с контрольной группой. При этом внутриартериальное введение ИПСК-НПК оказалось более эффективным, поскольку способствовали более быстрому (к 7-м суткам) улучшению неврологического статуса. Также было показано, что только внутриартериальное введение ИПСК-НПК приводило к уменьшению объема очага инфаркта. Также было выполнено исследование по внутриартериальному введению белково-пептидных препаратов, изготовленных на основе лизата нейрональных/глиальных культур и секретома глиальных предшественников. В работе было показано, что введение обоих типов белково-пептидных препаратов вызывало уменьшение неврологического дефицита по сравнению с группой контроля. Однако введение глиального секретома оказывало более выраженное действие и способствовало более быстрому улучшению неврологического статуса. При этом не было выявлено значимого влияния на выживаемость, скорость набора массы тела и изменение объема очага инфаркта мозга у лабораторных животных. Также было продемонстрировано терапевтическое действие прототипа ноотропного препарата. Оно было схоже с действием белково-пептидного комплекса, полученного на основе лизата нейрональных/глиальных культур.

Дополнительно были выполнены in vitro исследования, включающие изучение нейропротективного действия кондиционированных сред, полученных в условиях гипоксии и теплового шока. Данные о способе получения белково-пептидного комплекса на основе кондиционированных сред, полученных из нейрональных/глиальных культур, позволили подготовить три заявки на патент: 

• Заявка на изобретение №2019144075 от 26.12.2019 «Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из глиальных прогениторных клеток в условиях теплового шока, и способ её получения», РФ.
• Заявка на изобретение №2019144078 от 26.12.2019 «Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейрональных прогениторных клеток в условиях гипоксии, и способ ее получения», РФ.
• Заявка на изобретение №2019144080 от 26.12.2019 «Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейрональных прогениторных клеток в условиях теплового шока, и способ ее получения», РФ.

Полученные результаты соответствуют требованиям к выполняемому проекту.