Project implementation under Grant Agreement №14.604.21.0184 dated 26 September 2017 with the Ministry of Education and Science of Russia according to the federal target program “Research and Development in priority areas of development of the Russian Scientific and technological Complex for 2014-2020” with a purpose of Development of a personalized nootropic drug derived from human induced pluripotent stem cells
Выполнение проекта по Соглашению о предоставлении субсидии №14.604.21.0184 от «26» сентября 2017 г. с Минобрнауки России в рамках федеральной целевой программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2014-2020 годы» по теме: «Разработка персонализированного ноотропного препарата, полученного на основе индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека»
На этапе № 1 проекта в период с 26.09.2017 г. по 31.12.2017 проведены следующие работы:
- Выполнен аналитический обзор современной научно-технической, нормативной, методической литературы, затрагивающей научно-техническую проблему разработки ноотропного препарата на основе нейрональных клеток человека, исследуемую в рамках ПНИ.
- Создана материально-техническая база для выполнения ПНИ.
- Проведены патентные исследования в соответствии ГОСТ Р 15.011-96.
- Разработан предварительный протокол получения белково-пептидного комплекса на модельной системе фибробластов человека.
- Разработан протокол культивирования и протокола криоконсервации ИПСК человека. Получено необходимое количество и криоконсервированы культуры ИПСК человека в xeno-free условиях для нейрональной дифференцировки (2,5 млрд клеток)
- Разработан протокол получения ИПСК человека. Получены и охарактеризованы первичные культуры ИПСК из соматических клеток человека (не менее 2 клонов от 5 различных доноров).
- Получены культуры фибробластов человека для разработки предварительного протокола получения белково-пептидного комплекса.
На данном этапе обоснованы и выбраны направления исследований и разработок. Был отработан метод лизиса фибробластов человека и изучен состав компонентов белково-пептидного комплекса фибробластов при их фракционировании методом ионообменной хроматографии. На основе полученных результатов был разработан предварительный протокол получения белково-пептидного комплекса на модельной системе фибробластов человека. Разработан протокол получения ИПСК человека. Получены и охарактеризованы первичные культуры ИПСК из соматических клеток человека. Плюрипотентность 10 клонов ИПСК человека, полученных от 5 доноров, была подтверждена на молекулярном и на функциональном уровнях. Было показано, что все 10 клонов ИПСК экспрессируют гены плюрипотентности.
В результате проведенной работы были подобраны оптимальные условия для культивирования и криоконсервации культур ИПСК человека, что позволило увеличить выживаемость клеток после размораживания до 90%. На культурах фибробластов человека проведен комплекс исследований по разработке предварительного протокола получения белково-пептидного комплекса.
В результате реализации Проекта будут разработаны экспериментальные и технологические подходы для создания ноотропного лекарственного препарата нового поколения. Разрабатываемый инновационный ноотропный препарат отвечает направлению дорожной карты «Биомедицина» и «Здоровое долголетие» Хелснет Национальной технологической инициативы и влияет на контрольные показатели реализации дорожной карты - доли персонализированных лекарственных средств и биомедицинских клеточных продуктов с полным циклом производства в Российской Федерации.
Предлагаемые решения по разработке ноотропного препарата предлагаются впервые.
Полученные результаты соответствуют требованиям к выполняемому проекту.
На этапе № 2 проекта в период с 01.01.2018 г. по 31.12.2018 проведены следующие работы:
- Разработан протокол нейральной дифференцировки ИПСК человека. Проведена стандартизация получаемых нейрональных/глиальных культур.
- Проведена морфологическая и иммуноцитохимическая характеристика культур нейрональных/глиальных клеток.
- Проведена оценка профиля экспрессии ключевых маркеров нейрогенеза.
- Разработан протокол получения белково-пептидного комплекса из культур нейрональных/глиальных клеток человека.
- Получены экспериментальные образцы белково-пептидного комплекса из культур нейрональных/глиальных клеток человека
- Разработан лабораторный регламент получения прототипа ноотропного препарата на основе белково-пептидного комплекса из культур нейрональных/ глиальных клеток человека.
- Исследован профиль экспрессии генов маркеров нейрогенеза методом ПЦР в режиме реального времени.
- Проведено наращивание и криоконсервация культур ИПСК человека в xeno-free условиях для нейрональной дифференцировки (3,5 млрд клеток)
- Проведена молекулярно-генетическая характеристика культур клеток путем транскриптомного анализа.
- Охарактеризован качественный и количественный состав белково-пептидного комплекса
- Разработан протокол контроля качества клеточных культур на этапах получения ИПСК человека и нейрональных/глиальных клеток
- Проведена оценка нейропротекторного и нейротрофического действия экспериментальных образцов белково-пептидного комплекса in vitro
- Получены экспериментальные образцыв культур нейрональных/ глиальных клеток человека для получения белково-пептидных комплексов
- Разработаны условия хранения, упаковки, транспортировки прототипа ноотропного препарата
- Подготовлены 2 заявки на патент.
На данном этапе проекта разработан протокол нейральной дифференцировки ИПСК человека в 3D системе с использованием на первом этапе малых молекул LDN193189, SB431542, дорсоморфина, на втором этапе - фактора роста FGF-2 и пурморфомина, а на третьем - нейротрофического фактора BDNF. Нейральные стволовые клетки (НСК) представляли собой мелкие клетки, идентичные по морфологии клеткам нейроэпителия нервной трубки и экспрессировали маркеры PAX6, Nestin, SOX2 и FOXP2. Тела зрелых нейронов и астроглии имели отросчатую форму и иммуноцитохимически окрашивались на TUBB3, MAP2 и GFAP, соответственно. Методом ПЦР в режиме реального времени показан высокий профиль экспрессии SOX2, PAX6, FOXP2, Nestin, TUBB3 при нейральной дифференцировке. С помощью транскриптомного анализа выявлена активация сигнальных путей, задействованных в процессе нейрогенеза в период эмбрионального развития. Путем протеомного анализа исследован белковый состав клеточных лизатов, полученных из клеток на разных стадиях нейральной дифференцировки.
Выбран оптимальный способ экстрагирования белка из клеточных культур, основанный на лизисе в буфере Tris-HCl и низкоскоростном центрифугировании, позволяющий получить белково-пептидный комплекс, содержащий 60±2,7 пг/мл BDNF, 46,5±11,2 пг/мл NT-4, 38,61±1,04 пг/мл NGF из 2,5 миллионов клеток. Хранение белково-пептидного комплекса рекомендовано при -20°С. В результате хроматографического разделения белково-пептидного комплекса получена фракция отрицательно-заряженных белков, очищенная от нуклеиновых кислот.
В результате проведенного исследования in vitro в модели глутаматной токсичности на культуре мозжечковых нейронов крыс и на культуре PC-12 было подтверждено, что БПК из нейронально/глиальных клеток, полученный по разработанному в ходе проекта протоколу, способен оказывать нейропротекторное и нейротрофическое действие, превосходящее по эффективности действие коммерческого препарата «Церебролизин».
Полученные данные о способе получения и составе белково-пептидного комплекса позволили подготовить две заявки на патент:
Заявка на изобретение №2018118201 от 17.05.2018 «Способ получения ноотропной композиции на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейронов и глиальных клеток, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека», РФ.
Заявка на изобретение №2018118199 от 17.05.2018 «Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейронов и глиальных клеток, полученных методом направленной дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека».
Полученные результаты соответствуют требованиям к выполняемому проекту.
На этапе № 3 проекта в период с 01.01.2019 по 31.12.2019 проведены следующие работы:
- Получены экспериментальные образцы прототипа ноотропного препарата на основе белково-пептидного комплекса для экспериментальных исследований;
- Разработаны протоколы экспериментального исследования эффективности культуры нейрональных/глиальных клеток, белково-пептидного комплекса из культур нейрональных/глиальных клеток человека и прототипа ноотропного препарата на основе белково-пептидного комплекса in vivo на модели острой фокальной ишемии головного мозга у крыс методом транзиентной окклюзии средней мозговой артерии;
- Исследованы терапевтические эффекты экспериментальных образцов прототипа ноотропного препарата на основе белково-пептидного комплекса на модели транзиентной окклюзии средней мозговой артерии 90 мин;
- Исследованы терапевтические эффекты экспериментальных образцов культур нейрональных/глиальных стволовых клеток после системной трансплантации крысам в модели транзиентной окклюзии средней мозговой артерии 90 мин;
- Проведена оценка очага инфаркта мозга и других церебральных изменений с помощью магнитно-резонансной томографии, неврологического дефицита, массы и выживаемости животных в динамике;
- Проведено обобщение результатов ПНИ, проверка их соответствия требованиям ТЗ, оценка результативности ПНИ и эффективности результатов в сравнении с современным научно-техническим уровнем;
- Подготовлены предложения и рекомендации по реализации (коммерциализации) результатов ПНИ, вовлечению их в хозяйственный оборот;
- Разработан проект ТЗ на ПНИЭР Доклиническое исследование разработанного ноотропного препарата.
- Подготовлены 3 заявки на патент.
На 3 этапе проводились исследования по изучению эффектов внутриартериальной и внутривенной трансплантации ИПСК-НПК. Результаты показали, что в обоих случаях системного введения клетки оказывают положительное терапевтическое воздействие на течение экспериментального ишемического инсульта у крыс. Системная трансплантация достоверно улучшала выживаемость лабораторных животных и набор массы тела в острейшем периоде инсульта. Также происходило ускорение уменьшения выраженности неврологического дефицита животных по сравнению с контрольной группой. При этом внутриартериальное введение ИПСК-НПК оказалось более эффективным, поскольку способствовали более быстрому (к 7-м суткам) улучшению неврологического статуса. Также было показано, что только внутриартериальное введение ИПСК-НПК приводило к уменьшению объема очага инфаркта. Также было выполнено исследование по внутриартериальному введению белково-пептидных препаратов, изготовленных на основе лизата нейрональных/глиальных культур и секретома глиальных предшественников. В работе было показано, что введение обоих типов белково-пептидных препаратов вызывало уменьшение неврологического дефицита по сравнению с группой контроля. Однако введение глиального секретома оказывало более выраженное действие и способствовало более быстрому улучшению неврологического статуса. При этом не было выявлено значимого влияния на выживаемость, скорость набора массы тела и изменение объема очага инфаркта мозга у лабораторных животных. Также было продемонстрировано терапевтическое действие прототипа ноотропного препарата. Оно было схоже с действием белково-пептидного комплекса, полученного на основе лизата нейрональных/глиальных культур.
Дополнительно были выполнены in vitro исследования, включающие изучение нейропротективного действия кондиционированных сред, полученных в условиях гипоксии и теплового шока. Данные о способе получения белково-пептидного комплекса на основе кондиционированных сред, полученных из нейрональных/глиальных культур, позволили подготовить три заявки на патент:
- Заявка на изобретение №2019144075 от 26.12.2019 «Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из глиальных прогениторных клеток в условиях теплового шока, и способ её получения», РФ.
- Заявка на изобретение №2019144078 от 26.12.2019 «Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейрональных прогениторных клеток в условиях гипоксии, и способ ее получения», РФ.
- Заявка на изобретение №2019144080 от 26.12.2019 «Ноотропная композиция на основе полипептидных комплексов, выделенных из нейрональных прогениторных клеток в условиях теплового шока, и способ ее получения», РФ.
Полученные результаты соответствуют требованиям к выполняемому проекту.