Состоялась пятая Всероссийская мультимедийная конференция с международным участием «Генная терапия: настоящее и будущее»

Организатором выступила Ассоциация медицинских генетиков при поддержке Медико-генетического научного центра имени академика Н.П. Бочкова.

Эксперты обсудили различные подходы генной терапии, результаты применения препаратов, которые доступны на сегодняшний день, разработку новых лекарственных средств. Конференция проходила в течение 2 дней и включала пленарные заседания, 9 симпозиумов и секций.

Модератором первой пленарной секции выступили директор Медико-генетического научного центра имени академика Н.П. Бочкова, главный внештатный специалист по медицинской генетике Минздрава России, академик РАН Сергей Куцев и заведующая лабораторией редактирования генома МГНЦ, к.м.н., доцент Светлана Смирнихина. Сергей Куцев подчеркнул, что конференция дает возможность обсудить существующие методы терапии наследственных болезней и перспективные разработки на высоком экспертном уровне, а материалы докладов, посвященных эффективности существующих генотерапевтических препаратов и перспективным разработкам новых лекарственных средств, могут служить хорошими пособиями для молодых специалистов.

Дефицит декарбоксилазы ароматических аминокислот (AADC)

Заболевание является врожденным нарушением биосинтеза нейромедиаторов. Недостаточность фермента приводит к тяжелому комбинированному дефициту дофамина, серотонина и других катехоламинов. Клинически болезнь проявляется гипотонией, двигательными расстройствами, вегетативными симптомами, в том числе, повышенным потоотделением. Характерный симптом – это окулогирные кризы. Фермент AADC, необходимый для синтеза нейротрансмиттеров, кодируется геном DDC, который экспрессируется, в основном, в головном мозге, печени, соматических ганглиях и коре надпочечников. На сегодняшний день установлен 581 вариант в гене DDC, большинство из них считаются патогенными или вероятно патогенными.

Генотерапевтический препарат для лечения декарбоксилазы ароматических аминокислот – один из самых дорогих в мире, он доступен детям благодаря фонду «Круг добра». В прошлом году уникальную операцию на головном мозге провели первому российскому пациенту. В связи с доступностью лечения, актуальным вопросом становится ранняя диагностика заболевания. Заведующая отделом молекулярных механизмов наследственных нарушений метаболизма МГНЦ, д.м.н. Екатерина Захарова отметила, что в Медико-генетическом научном центре имени академика Н.П. Бочкова есть возможность проводить все этапы диагностики как биохимическими, так и молекулярно-генетическими методами. По ее экспертной оценке, самый надежный биомаркер – 3-О-метилдопа, уровень которого можно измерять в высушенном пятне крови методом тандемной масс-спектрометрии. Кроме того, в лаборатории разрабатывают ряд маркеров, производных нейромедиаторов, которые можно оценивать в цереброспинальной жидкости, и методы оценки активности ферментов в плазме крови.

– Необходимо иметь четкие диапазоны референсных значений активности этих ферментов. Было показано, что 3-О-метилдопа подходит для оценки при скрининге новорожденных. Совместно с коллегами из Екатеринбурга и Санкт-Петербурга мы провели ретроспективный анализ образцов. Работа позволила собрать данные по определению уровня этого биомаркера у новорожденных, и теперь у нас есть возможность включить заболевание в неонатальный скрининг. Для работы можно использовать уже имеющееся оборудование. Дефицит декарбоксилазы ароматических аминокислот включен в скрининг в Тайвани. Исследование прошли 127 987 новорожденных, и заболевание выявлено у 4 детей. Таким образом частота превысила ожидаемую и составила 1:32 000, – рассказала Екатерина Захарова.

Пока заболевание не включено в неонатальный скрининг, врачи могут воспользоваться бесплатной диагностической программой МГНЦ.

Проблема регистра миодистрофии Дюшенна-Беккера

Сегодня для терапии мышечной дистрофии Дюшенна-Беккера детям доступны как зарегистрированные в России, так и незарегистрированные лекарственные средства, которые закупает фонд «Круг добра». Среди них – генозаместительный препарат деландистроген моксепарвовек.

По оценке экспертов МГНЦ, в России статистически значимо реже выявляются крупные делеции гена DMD. Чаще к заболеванию приводят крупные дупликации и точковые варианты гена, в том числе, нонсенс-мутации. В перечни «Круга добра» включен генотерапевтический препарат, показанный именно для таких пациентов. Одно из условий его назначения – возраст до 5 лет. При этом, согласно регистру МГНЦ, средний возраст постановки диагноза – 7 – 8 лет. Как заявлялось ранее, миодистрофия Дюшенна-Беккера может быть включена в расширенный неонатальный скрининг, это позволит выявлять заболевание значительно раньше. Однако сегодня актуален вопрос о контроле эффективности генотерапевтических препаратов. Для оценки этого критерия необходимо вести регистр.

– Основная проблема регистра заключается в том, что лишь для небольшого количества пациентов есть данные динамического наблюдения, в основном, сведения о пациентах внесены однократно. Одна из задач регистра – это оценка эффективности терапевтических подходов, и на сегодняшний день для этого недостаточно информации. В среднем каждый третий пациент в регистре имеет генотип, подходящий под тот или иной препарат патогенетической терапии. Под генную терапию подходят 124 пациента, что обусловлено, в основном, поздней постановкой диагноза, – рассказал заведующий лабораторией функционального анализа отдела функциональной геномики МГНЦ, к.м.н. Петр Спарбер.

Генная терапия в офтальмогенетике

Амавроз Лебера 2 типа и пигментный ретинит 20 типа, вызванные патогенными вариантами в гене RPE65, стали первыми нозологиями в офтальмологии, для которых была внедрена генозаместительная терапия. Заведующий отделением и кафедрой офтальмогенетики ИВиДПО МГНЦ, куратор по наследственным глазным болезням РФ, д.м.н., доцент Виталий Кадышев отметил, что разнообразие новых исследований, которые ведутся сегодня, в том числе, в России, дает надежду, что круг лекарственных средств расширится. Существующий препарат имеет строгие критерии назначения, среди которых возраст от 3 до 18 лет.

– Рекомендуемый возраст назначения – с 4 лет, однако в России есть опыт применения у трехлетнего ребенка. Верхняя возрастная граница в мире – 67 лет, в России самому старшему пациенту, получившему препарат, было 46 лет, у него также отмечался положительный эффект. Второй критерий назначения – наличие жизнеспособных клеток сетчатки. Их определяют с помощью томограммы. Для назначения препарата необходимо, чтобы толщина сетчатки была от 100 микрон. Более 30 детей уже обеспечены лекарственным препаратом, все они находятся на динамическом наблюдении в МГНЦ, и у всех отмечается положительный эффект, – рассказал Виталий Кадышев.

Для лечения нейротрофического кератита также создан таргетный препарат, который поддерживает целостность роговицы за счет трех механизмов действия. Это препарат второй линии, он назначается в том случае, если препараты первой линии не показали эффективность. Нейротрофический кератит может развиваться, в том числе, при генетических заболеваниях, таких как мукополисахаридоз 1 типа, синдромы Горлина, Пфайфера, а также встречается изолированная наследственная дистрофия роговицы. За счет средств фонда «Круг добра» препаратом теперь обеспечиваются дети в возрасте от 1 года, и сегодня его получили больше 100 пациентов. За счет средств регионов 6 взрослых пациентов обеспечены терапией. Третья нозология, для которой разработана патогенетическая терапия, это наследственная нейропатия Лебера.

– Критерии назначения препарата были пересмотрены в конце марта этого года, нам удалось снизить возраст назначения с 12 до 6 лет. Также добавлена хроническая фаза заболевания, поскольку исследование показало, что заболевание в этой фазе также имеет хороший ответ на терапию. За счет средств фонда «Круг добра» около 25 детей уже обеспечены лекарством. Стоит отметить, что для терапии нейропатии Лебера разрабатывается также генозаместительный препарат. Предполагается, что в будущем его можно будет совмещать с патогенетическим лечением, – отметил Виталий Кадышев.

Редактирование генома

В лаборатории экспериментальной генетической терапии наследственных болезней обмена веществ МГНЦ ведутся исследования по редактированию митохондриальной ДНК (мтДНК) человека, в которых используется инновационная технология CRISPR/Cas12a. Илья Мазунин, ведущий научный сотрудник лаборатории, автор исследования, еще в 2018 году предложил использовать две гидовые РНК, которые после разрезания цепи ДНК митохондрий формируют липкие комплементарные концы. В дальнейшем они способны к религированию (сшиванию между собой) и формированию сайт-направленных делеций. Это, в свою очередь, могло бы стать эффективным инструментом в создании модельных систем, имитирующих заболевания человека, ассоциированные с делециями в мтДНК. В скором времени ожидается выход научной статьи. По его мнению, важнейшим вопросом в области редактирования мтДНК с использованием систем CRISPR является вопрос импорта РНК в митохондрии клеток человека. Группа Ильи Мазунина показала, что гидовые РНК, таргетирующие нуклеазу Cas12a, могут проникать в митохондрии и выполнять свои функции без дополнительных модификаций, что может значительно упростить и повысить точность митохондриальной генной терапии. Кроме того, гидовые РНК для нуклеазы Cas12a могут быть разделены на две части, спейсерную и скаффолдную, что позволяет повысить эффективность импорта в митохондрии, поскольку существуют естественные природные механизмы импорта в митохондрии микроРНК и малых интерферирующих РНК, имеющих схожую длину с расщепленными гидовыми РНК для Cas12a.

В лаборатории редактирования генома Медико-генетического научного центра имени академика Н.П. Бочкова ведут исследования по поиску вариантов геномного редактирования при миодистрофии Дюшенна-Беккера. Специалисты сосредоточились на работе с экзонами 11 и 12, выбрали наиболее подходящие гидовые РНК, которые показали в экспериментах лучший результат. В МГНЦ также разрабатывают подход восстановления рамки считывания путем разрушения сайтов сплайсинга. В экспериментах уже подобраны наиболее эффективные гидовые РНК для экзонов 43-53, и специалисты лаборатории рассчитывают продолжить работу уже на клетках пациентов.

Проблема разработки этиотропной терапии при муковисцидозе по-прежнему остается актуальной – существующие препараты необходимо принимать в течение всей жизни, кроме того, они имеют побочные эффекты. В отличии от них, перспективные препараты на основе технологии геномного редактирования потребуют однократного введения.

Специалисты лаборатории провели большую работу по подбору методов редактирования, средств доставки, оценки точности и эффективности их действия для коррекции мутации F508del гена CFTR. В результате удалось подобрать два варианта молекул, которые преодолевают порог эффективности в 10%, необходимый для нормализации транспорта ионов хлора в клетках. Это позволяет экспертам рассматривать молекулы как потенциально пригодные для дальнейшей разработки терапии.

– Если суммировать результаты всех экспериментов на всех клеточных линиях, то можно выделить два лидирующих варианта с хорошей эффективностью и точностью. Праймированное редактирование показало более высокую точность по сравнению с классическим CRISPR-Cas. Восстановление работы канала CFTR мы оценивали с помощью форсколинового теста на легочных органоидах. Уровень ответа редактированных клеток на форсколин был сопоставим с уровнем ответа органоидов на препарат тройной терапии, который сейчас является препаратом первой линии лечения. Но в сравнении с органоидами здорового донора, удается достичь примерно 20% проводимости канала. В целом результат сопоставим с патогенетической терапией, однако наш метод – однократного введения. Сейчас в лаборатории собрано 6 вариантов вирусных и невирусных векторов доставки. Главная задача – создать модельных животных с муковисцидозом, которые сегодня отсутствуют в России, – рассказала заведующая лабораторией редактирования генома МГНЦ, к.м.н. Светлана Смирнихина.

Этические аспекты

Заместитель директора по научной работе МГНЦ, председатель Российского общества медицинских генетиков, заведующая кафедрой биоэтических проблем медицинской генетики ИВиДПО МГНЦ, д.м.н., доцент Вера Ижевская подчеркнула, что разработка и испытания новых препаратов генной терапии имеют свои особенности. В частности, классические клинические испытания могут быть затруднены из-за малого количества пациентов. Взвесить потенциальную пользу и риски оказывается непросто.

Среди международных документов, которые определяют порядок планирования и проведения клинических исследований, основным является Хельсинкская декларация. Основные ее положения отражены в российском законодательстве. В прошлом году этот документ отметил свое 60-летие, и был в очередной раз пересмотрен.

– Новая редакция говорит о «добровольном осознанном информированном согласии». Получить такое согласие – непростая задача, поскольку от врача, исследователя, требуются хорошие коммуникативные навыки. Пациент должен суметь оценить риски и сделать осознанный выбор. В последнем параграфе Хельсинкской декларации появилось положение о так называемых непроверенных вмешательствах в клинической практике. Имеется ввиду разработка индивидуальных препаратов, которые применяются по жизненным показаниям. Допуская применение таких препаратов без клинических исследований, документ завершается заявлением, что в последующем это вмешательство должно стать объектом исследования для оценки безопасности. Информация должна регистрироваться и, при необходимости, быть общедоступной. Кроме того, в Хельсинкской декларации подчеркивается роль этических комитетов. Работа комитетов налажена при проведении клинических исследований медицинских изделий и лекарственных препаратов. Однако на этапе исследовательской работы их роль выпала из законодательства. Сейчас готовятся изменения в закон «О науке и государственной научно-технической политике», в нем должно появиться понятие о независимых этических комитетах в науке. Проблема в том, как сделать эти структуры независимыми, и достаточно ли этической экспертизы в той организации, которая ведет разработку, или же нужна экспертиза на независимой площадке, – отметила Вера Ижевская.