Эксперты обсудили актуальные вопросы генной терапии

14 декабря 2023 года в онлайн-формате прошла Всероссийская мультимедийная конференция «Генная терапия: настоящее и будущее». Организатором мероприятия выступила Ассоциация медицинских генетиков при поддержке Медико-генетического научного центра имени академика Н.П. Бочкова.

Пленарное заседание открыли директор Медико-генетического научного центра имени академика Н.П. Бочкова, академик РАН Сергей Куцев и заведующая лабораторией редактирования генома МГНЦ, к.м.н. Светлана Смирнихина.

Заведующий кафедрой патологической анатомии ФГБОУ ВО СЗГМУ имени И.И. Мечникова Минздрава России, научный директор ПАО «Институт стволовых клеток человека», к.м.н. Роман Деев прочитал доклад «Генная терапия: от фантазий ученых к повседневной практике». Докладчик остановился на истории развития, основных понятиях и специфике метода генной терапии, привел примеры клинических исследований.

«За последние два десятилетия было зарегистрировано более 25 генотерапевтических препаратов. На сегодняшний день генная терапия является одним из средств лечения, которое дополняет арсенал врачебных методов в тех областях, где других средств нет», - отметил Роман Деев.

Старший научный сотрудник лаборатории наследственных болезней обмена веществ МГНЦ, к.м.н. Игорь Бычков рассказал о подходах к терапии наследственных заболеваний на основе антисмысловых молекул. Ученый рассказал об истоках и принципах антисмысловой терапии, а также коррекции сплайсинга на примере мышечной дистрофии Дюшенна.

«Причина миодистрофии Дюшенна заключается в наличии патогенных вариантов в гене DMD, преимущественно крупных делеций и дупликаций, нарушающих рамку считывания гена. В случае делеций и инсерций, сохраняющих рамку считывания гена, развивается более легкий фенотип – миодистрофия Беккера. Сплайсинг гена DMD является актуальной мишенью для антисмысловых молекул, так как позволяет восстановить рамку считывания гена», - рассказал Игорь Бочков.

В качестве эффективных инструментов коррекции сплайсинга используют кольцевые РНК и малую ядерную РНК U1.

Заведующая лабораторией редактирования генома МГНЦ, к.м.н. Светлана Смирнихина остановилась на методе геномного редактирования как основе современной генотерапии. Эксперт рассказала про преимущества и недостатки метода. К основным преимуществам она отнесла необратимость изменений, легкость дизайна и доставки в клетку, относительно высокую эффективность. К недостаткам классического CRISPR/Cas9 отнесены низкая специфичность, низкая частота гомологичной репарации, низкая частота редактирования обоих аллелей и невозможность исправления анеуплоидий.

С помощью метода геномного редактирования можно прицельно исправлять мутации (однонуклеотидные замены, короткие инсерции и делеции, комбинации этих мутаций). Для этого в клетку необходимо привнести донорную молекулу ДНК, содержащую правильную последовательность участка гена, который требуется заменить. С помощью пути направленной гомологичной репарации эта последовательность будет встраиваться в месте поврежденной ДНК. На данном принципе построены подходы к коррекции практически всех мутаций, приводящих к моногенным заболеваниям (например, ген CFTR при муковисцидозе, ген HBB при бета-талассемии, ген FAH при тирозинемии и др.).

При использовании длинных донорных молекул ДНК можно встроить в место двуцепочечного разрыва ДНК большой фрагмент, например, несколько экзонов или даже полную кодирующую последовательность гена в выбранную исследователем область генома.  Таким образом, можно разработать лечение, подходящее всем пациентам с любыми мутациями в конкретном гене. Например, вставить ген CFTR для лечения муковисцидоза.

Для моногенных заболеваний с аутосомно-доминантным типом наследования (с мутациями по типу gain-of-function) можно использовать подход по нокауту мутантного аллеля. При этом экспрессия белка целенаправленно выключается с мутантного аллеля, тогда как с нормального остается, что может приводить к уменьшению симптомов заболевания. Такой подход может быть применен, например, для лечения наследственных форм кардиомиопатий, связанных с мутациями в гене DES.

«На сегодняшний день в мире проводится 92 клинических исследования препаратов и технологий с использованием методов редактирования генома. Практически 70 исследований инициировано с использованием метода CRISPR/Cas9. Основная доля методов проводится для лечения онкологических заболеваний», - рассказала Светлана Смирнихина.

Светлана Смирнихина отметила, что одной из сложностей генной терапии и геномного редактирования является доставка генетических конструкций в живой организм. Сегодня существует два подхода: in vitro и ex vivo. Первый подход осуществляется непосредственно на тканях живого организма с использованием адресной доставки нуклеиновых кислот. Подход ex vivo заключается в редактировании клеток вне организма больного. Для этого клетки пациента забирают, далее в них вносят компоненты геномного редактирования, отбирают успешно отредактированные клетки, производят их экспансию и затем трансплантируют обратно пациенту. Особенностями подхода ex vivo являются полный контроль за специфическими и неспецифическими изменениями в геноме, высокая эффективность за счет отбора редактированных клеток и их экспансии, трудозатратность. Данный подход возможен лишь для ряда заболеваний – бета-талассемия, серповидно-клеточная анемия, ВИЧ-инфекция.

Эксперт остановилась на многообразии модификаций метода CRISPR/Cas9, которые существенно расширяют возможности и сферу применения метода. К основным модификациям CRISPR/Cas9 относят редакторы оснований, активаторы транскрипции, праймированное редактирование, редактирование РНК.

Одним из модераторов секции «Генная терапия моногенных заболеваний. Часть 1» выступила старший научный сотрудник лаборатории редактирования генома МГНЦ, врач-генетик, к.м.н. Ольга Левченко. В своем докладе врач-генетик осветила вопросы применения технологии CRISPR/Cas9 в лечении мышечных дистрофий.

Самой частой мышечной дистрофией является X-сцепленная мышечная дистрофия Дюшенна. Одна из самых частых рецессивных мышечных дистрофий – дисферлинопатия. Эти заболевания имеют некоторое количество общих черт. Во-первых, оба гена, которые кодируют белки дистрофин и дисферлин, достаточно большие и они отвечают за целостность мышечного волокна. Дистрофин оберегает мышечное волокно от разрыва, а дисферлин восстанавливает мембрану после повреждений. При данных заболеваниях наблюдается некоторая зависимость тяжести клинической картины от типа патогенного варианта. Тяжелые генетические варианты в гене DMD приводят к развитию мышечной дистрофии Дюшенна – тяжелого инвалидизирующего состояния с достаточно низкой продолжительностью жизни. При более мягких мутациях гена без сдвига рамки считывания (например, миссенс вариантах) возникает мышечная дистрофия Беккера, либо наиболее легкий вариант – X-сцепленная дилатационная кардиомиопатия, которая не сопровождается потерей двигательной функции. Пациенты продолжают ходить на протяжении всей своей жизни.

Для дисферлинопатии не наблюдается яркая зависимость тяжести клинической картины от типа генетических вариантов. Однако существует некоторое количество доказанных вариантов (делеции без сдвига рамки считывания экзонов 26, 27, 28, 29), при которых функция репарации мембраны находится на уровне здоровых клеток.

«Основными механизмами восстановления рамки считывания или пропусков экзонов является внесение индела. Если есть короткая делеция или инсерция, приводящая к сдвигу рамки считывания, соответственно, к возникновению преждевременного стоп-кодона и деградации белка, то при внесении дополнительного индела с помощью системы CRISPR/Cas9 рамка считывания восстанавливается. Также может применяться вырезание экзона, т.е. если делеция одного из экзонов нарушает рамку считывания, то мы можем дополнительно удалить второй экзон и, таким образом, остановить рамку считывания. Либо разрушение сайта сплайсинга – тогда на уровне ДНК экзон не пропускается, но преобразование транскрипта и его созревание могут быть пропущены на уровне РНК», - отметила Ольга Левченко.

 «В своей работе мы применяем все эти подходы, в том числе, вырезание экзонов. Мы вырезаем 11 и 12 экзоны, делеция которых не приводит к сдвигу рамки считывания. Эти экзоны выбраны не случайно - на сегодняшний день разрабатывается не так много вариантов терапии для пациентов, имеющих мутации в регионе с 9 по 20 экзоны. Нами сформирована выборка пациентов с патогенными вариантами внутри этих экзонов. К данным вариантам мы можем применить технологии пропуска экзонов», - рассказала Ольга Левченко.

Научный сотрудник лаборатории редактирования генома МГНЦ Ольга Володина прочитала доклад «Праймированное редактирование мутации F508del в гене CFTR».

Кроме того, в этой секции были представлены доклады сотрудников Института биологии гена РАН и ООО «Марлин Биотех» (Татьяна Егорова и Иван Галкин), а также АО Биокад (Мария Морозова) о разработках в области генотерапии, которые ведутся в их организациях.

Модераторами секции «Генная терапия моногенных заболеваний. Часть 2» выступили член-корреспондент Академии наук Республики Татарстан, руководитель центра превосходства «Персонифицированная медицина» института фундаментальной медицины и биологии ФГАОУ ВО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», д.б.н., профессор Альберт Ризванов и старший научный сотрудник Центра молекулярной и клеточной биологии Сколтеха, к.б.н. Илья Мазунин. 

Альбер Ризванов рассказал про современные аспекты генной терапии лизосомных болезней накопления.

Ведущий научный сотрудник Института детской эндокринологии ФГБУ НМИЦ эндокринологии, заведующая лабораторией молекулярной эндокринологии Института регенеративной медицины МНОЦ ФГБОУ ВО МГУ им. М.В. Ломоносова, заведующая лабораторией терапии орфанных заболеваний ФГАОУ ВО МФТИ НИУ, к.м.н. Мария Воронцова затронула вопросы генной терапии в детской эндокринологии, в частности, in vivo генотерапии врожденной дисфункции коры надпочечников.

Илья Мазунин рассказал о генной терапии митохондриальных заболеваний.

Научный руководитель направления «Генная терапия» Научного центра трансляционной медицины Университета «Сириус», к.б.н. Александр Карабельский рассказал о разработке рекомбинатных вирусов для терапии онкологических и наследственных заболеваний.

Генеральный директор ООО «Генотаргет» Иван Яковлев прочитал доклад «Предварительные результаты доклинического исследования двухвекторной системы для лечения дисферлинопатии».

Модераторами секции «Генная терапия многофакторных заболеваний, онкологических и инфекционных заболеваний» выступили заведующий ЛБТ Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, к.б.н. Владимир Рихтер и Заместитель директора по научной работе Института молекулярной и экспериментальной медицины ФГБУ «НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева», к.б.н. Минздрава России Сергей Ларин.

Владимир Рихтер рассказал о первом российском онколитическом вирусе VV-GMCSF-Lact в клинических испытаниях.

Максим Карагяур (МГУ) прочитал доклад, посвященный ex vivo генетической модификации мезенхимных стромальных клеток, как подходу к управлению терапевтической активностью их секретома.

Сергей Ларин прочитал доклад, посвященный ex vivo генной терапии на примере технологии CAR-T.

Научный сотрудник лаборатории геномного редактирования высших эукариот, Центра высокоточного редактирования и генетических технологий для биомедицины Института биологии гена РАН, к.б.н. Александра Констанция Масленникова рассказала про генотерапию ВИЧ-1 на основе GPI-заякоренных C-пептидов.

Руководитель отдела биотехнологий НИИ ДОГиТ им. Р.М. Горбачевой ПСПбГМУ им. ак. И.П. Павлова, к.м.н. Кирилл Лепик рассказал об академической модели разработки применения продуктов генной клеточной терапии на основе клеток кроветворного ряда.

Вопросы тестирования эффективности доставки функциональных искусственных мРНК липосомами 2X3: DOPE и 2X7:DOPE на моделях in vitro и in vivo рассмотрел в своем докладе заведующий лабораторией геномного редактирования ИХБФМ СО РАН, к.х.н. Григорий Степанов.

Подробнее с программой конференции можно ознакомиться на сайте https://genetherapy.significo.ru/