Маленькие, но удаленькие

Виварий с «рыбками-исследовательцами» в 2024 году появился в Медико-генетическом научном центре имени академика Н. П. Бочкова. В его аквариумах может содержаться более сотни линий, моделирующих наследственные заболевания человека.

О том, как данио-рерио помогают медицинским генетикам устанавливать диагнозы и проводить высокотехнологичные научные исследования, рассказал журналу «RARUS: редкие болезни в России» заведующий отделом функциональной геномики МГНЦ, к.б.н. Михаил Скоблов.

Данио-рерио помогают медицинским генетикам устанавливать диагнозы и проводить высокотехнологичные научные исследования. Аквариумисты всего мира любят этих маленьких рыбок. Оливково-синие, с золотистым или серебряным отливом, они очень подвижны. Сегодня же данио-рерио начали помогать ученым.

Живой организм с «модельной внешностью»

Во времена СССР увлечение аквариумистикой было страстью многих школьников. Дети фанатично разводили в аквариумах барбусов и гуппи. Михаил Скоблов тоже не стал исключением: «Мне всегда нравилось наблюдать за рыбками. Может быть, данио-рерио не такие яркие и выразительные, как меченосцы или скалярии, но они оказались полезными для ученых». Данио-рерио — одни из самых известных модельных живых организмов, которые применяются в медицинской генетике. Вообще, таких модельных организмов существует множество: мушки-дрозофилы, мыши, крысы…

«Каждый модельный объект обладает уникальными свойствами и характеристиками, поэтому их применяют для решения разных задач, и все такие модельные объекты очень полезны. Дело в том, что фундаментальная наука не так сильно интегрирована в практическую медицинскую генетику. В основном ответы находят при исследовании семей с наследственными заболеваниями. Мало других объектов, которые помогли бы найти ответы на вопросы о патогенности мутаций, возникновении заболеваний, помогали бы исследовать патогенез наследственных болезней. При таком сценарии исследований, когда ученые опираются на информацию от семьи пациента, от человеческих клеточных культур, основная задача науки — собрать как можно больше пациентов, наблюдать за развитием заболевания. Но проблема в том, что теперь наука находит все больше очень редких и даже уникальных генетических изменений. Где в таких ситуациях взять данные, чтобы исследовать такие заболевания и состояния? Тут и помогают модельные животные».

Маленькие, неприхотливые и быстро размножаются

Данио-рерио заслужили славу в медицинской генетике благодаря простоте содержания большого количества особей, ведь они маленькие. Кроме того, рыбки очень быстро размножаются (каждые 15–20 дней), у них малая длительность эмбрионального развития (три дня). Рыбки неприхотливы, поэтому нет необходимости создавать специальные условия в виварии, которые необходимо поддерживать по ГОСТам. Для сравнения, чтобы завести мышей, необходимо пройти огромное количество проверок на соответствие СанПиН. Все это делает рыбок удобным объектом для наблюдения и манипуляций и позволяет проводить сравнительные эксперименты на потомстве, полученном от одной пары.

Данио-рерио – пресноводные рыбы семейства карповых. Впервые описаны канадским зоологом Фрэнсисом Гамильтоном в 1822 году. Маленькие (25–40 мм) тропические рыбки обитают в Южной и Юго-Восточной Азии. В 1970-х американский ученый Джордж Стрейсингер предложил использовать этот вид как модельный организм для изучения развития позвоночных на разных стадиях

На Земле и в космосе

Использование в исследованиях данио-рерио обладает большим потенциалом, но пока в России этим направлением занимаются единицы среди институтов. Для научной работы важно, что у этих рыб работает механизм внешнего оплодотворения, а эмбрион совершенно прозрачен. От момента оплодотворения до выхода особи из икринки проходит всего 96 часов. Кроме того, можно наблюдать развитие более чем 200 эмбрионов, полученных за один раз от одной самки. Для сравнения, беременность у мыши длится 19-21 день, при этом наблюдать за эмбрионом невозможно.

Данио-рерио стали первыми аквариумными генетически модифицированными организмами. В 2003 году им вживили флуоресцентный ген морских медуз – рыбки приобрели яркую флуоресцентную окраску и звучное имя GloFish

Виварий включает в себя помещение с автономной системой жизнеобеспечения для индивидуального содержания рыб. Оборудование оснащено системой для внесения генно-инженерных конструкций в эмбрионы рыб, а также высокотехнологичной системой регистрации внешних признаков. Эта система позволяет фиксировать и статистически регистрировать патологию развития нервно-мышечной, сердечно-сосудистой, выделительной и других систем и органов в процессе эмбриогенеза. Кроме того, оборудование помогает ставить поведенческие тесты и регистрировать частоту сердечных сокращений модельных животных.

Эти рыбки воспроизводятся в различных условиях, даже на космической станции

«Максимально близкое модельное животное после рыбок – мышь. Но, чтобы у мыши получить потомство с мутациями, нужно затратить на порядок больше времени, средств, людей и усилий. В этом плане рыбки – уникальный модельный организм. Мы давно хотели начать работу с ними, но нужно было решить организационные вопросы, закупить специальные системы, которые позволяют рыбок размножать раздельно друг от друга, чтобы их можно было генотипировать, тестировать, изучать. Такая система способна поддерживать сразу около сотни аквариумов, и можно одновременно наблюдать за большим количеством разных особей.

В целом данио-рерио ничем особо не отличаются от обыкновенных рыбок. Главный момент – когда мы получаем потомство от них, то можем вносить в него генетические изменения, чтобы исследовать, насколько мутации могут нарушать молекулярные процессы, приводящие к возникновению заболеваний».

Рыбка помогает экспериментально установить, как действует мутация

В 2023 году, например, в МГНЦ провели свыше 74 тысяч генетических исследований – исследования отдельных генов, полноэкзомные и полногеномные тесты. Во время тестирования нередко обнаруживаются новые варианты нуклеотидной последовательности, которые не описаны в научной литературе, их клиническое значение не известно, то есть нет информации об их возможной связи с болезнью. Однако врачам необходимо точное понимание, является ли тот или иной вариант причиной патологии. В лаборатории функциональной геномики МГНЦ в таких случаях проводят эксперименты, которые позволяют установить клиническое значение варианта нуклеотидной последовательности.

Теперь возможности для научных исследований расширятся благодаря рыбному виварию. Здесь живут около сотни обыкновенных рыбок. Каждая из пар дает несколько сотен икринок, в которые исследователи могут вносить различные генетические изменения. Далее ученые наблюдают, как потомство развивается.

«К примеру, у пациента нашли редкую мутацию, но не можем понять, действительно ли это она? Мы вносим специальные генетические конструкции с этой мутацией в модель, и мониторим ситуацию. Допустим, все икринки погибли на следующий день после внесения генетических конструкций с этой мутацией. Это означает, что мутация была действительно патогенной, запустила определенные молекулярные процессы, которые привели к гибели на уровне организма.

Или, скажем, нашли мутацию у пациента с наследственным заболеванием, которое приводит к нарушениям формирования скелета. Мы вносим генетические конструкции с подобного рода мутацией и наблюдаем, что из икринок получаются мальки с искривленным или укороченным позвоночником. Когда мы наблюдаем эти изменения у большого количества икринок и мальков, то можем уверенно говорить, что патогенность такой мутации подтверждена экспериментально.

Еще пример. Изучаем пациента с эпилептическими приступами. Имеются определенные гены, которые приводят к нарушению мозговых процессов передачи нервного импульса, и у пациента возникают судороги. На рыбных моделях такие исследования тоже возможно проводить. Когда мы вносим конструкции, на ранних стадиях рыбка начинает ввести себя аномально. Она может «бешено» вращаться, количество телодвижений и траектория перемещения будут сильно отличаться от обычной рыбки. И в принципе, изменения в поведении как признак патологии применимы к любым нозологиям.

Если изменения связаны с формированием мышечной ткани, то мы будем смотреть, в первую очередь, как белки организуются в скелетные структуры у рыбок. Если же вопрос касается репродуктологии, то насколько это сказывается на размножении рыбок впоследствии, то есть модель можно подстраивать и разрабатывать системы так, чтобы наблюдать повреждения аналогичных систем и органов на рыбках.

В целом нужно сказать, что, поскольку эмбрионов много, мы получаем данные очень хорошего качества, которым можно доверять».

Аристотель и Эразистрат одними из первых провели опыты на живых животных

70% генов гомологичны человеческим

«Да, таких рыбок можно купить практически в любом зоомагазине, но помочь в исследованиях они могут лишь при условии создания специальных конструкций с мутациями, при применении молекулярных технологий, которыми обладает наш Медико-генетический научный центр. Это исследования высокого уровня, технологически очень непростые, и они стоят недешево. Такого типа высокотехнологичные исследования только начинают развиваться не только в России, но и в мире».

Чтобы рыбки работали на науку, они должны регулярно приносить здоровое потомство, поэтому сейчас ученые совершенствуют и отлаживают этот технологический цикл, чтобы вся система работала, как часы. Сегодня геном данио-рерио полностью секвенирован, 70% его генов гомологичны генам человека. Это позволяет эффективно использовать данио-рерио для моделирования и анализа различных болезней человека, исследования фармакокинетики лекарственных препаратов, создания трансгенных моделей онкологических заболеваний.

Какие животные использовались в науке

Собаки. Кардиология, эндокринология, болезни костей и суставов. Часто опыты ставили на гончих собаках, поскольку считается, что у них более уравновешенная психика

Кошки. Неврологические исследования

Мыши. Наследственные заболевания человека: 99% генов мышей схожи с человеческими. Используют из-за небольшого размера, низкой стоимости, легкости содержания, высокой скорости размножения

Крысы. Психологические исследования, тесты на токсичность, онкологические заболевания

Человекообразные обезьяны. Токсикологические тесты, СПИД, гепатит, ксенотрансплантация, процессы размножения, неврологические, психологические, генетические исследования, разработки вакцины против полиомиелита, методы глубокой стимуляции мозга

IN VIVO или IN SILICO?

Все чаще ученые полностью или частично заменяют метод in vivo (испытания на живых организмах) на компьютерное моделирование in silico. Пока ученые считают, что методы нужно сочетать, полностью компьютер не может дать качественного исследования

IN SILICO: компьютерные модели

+

Быстро и дешево прогнозируют взаимодействие молекулы с белками, клетками, организмом

Отсекают опасные или неэффективные варианты

-

Модель зависит от качества данных

Не может полностью предсказать реальную физиологию живого организма

IN VIVO: эксперименты на животных

+

Показывают, как препарат реально действует

Изучаются безопасность, токсичность, побочные эффекты, фармакокинетика

-

Дорого, долго и имеет этические вопросы

Не всегда результаты полностью переносимы на человека