Онкоэпигенетика. Как найти и "выключить" опасные гены?
Беседовал: автор и ведущий программы Российского Радиоуниверситета Радио России Дмитрий Конаныхин
В прошлый раз мы говорили об эпигенетике. Давайте повторим для наших слушателей, что они должны знать, чтобы понимать сегодняшнюю беседу?
На фоне одного и того же генома в процессах развития и функционирования организма в норме разные гены должны «включаться» и «выключаться», в зависимости от функции органа. Например, при образовании эритроцитов «включаются» гены глобина, а в других клетках этого не происходит. Для слаженной работы организма существуют механизмы эпигенетической регуляции работы генов.
Очень простой механизм эпигенетической регуляции – метилирование ДНК. Метилирование — это присоединение метильной группы (–СН3) к одному из нуклеотидов ДНК - цитозину, в результате чего получается метилцитозин. Участки генома, в которых находится метилцитозин, «молчат», гены не экспрессируются, с них не синтезируется РНК, а, следовательно, и белок. Таким образом, метилирование приводит к «молчанию» генов, именно оно «включает» и «выключает» гены тогда, когда это необходимо для организма.
Метилирование ДНК – это нормальный процесс, но, если этот процесс запускается не тогда, когда необходимо и не там, где надо, возникают патологические результаты. Известны многие наследственные болезни, при которых наблюдается нарушение метилирования ДНК, но нет ни одного злокачественного новообразования, в биопсии которого мы бы не обнаружили нарушение метилирования ДНК.
Нарушение метилирования ДНК – это фундаментальный признак ракового генома.
Раньше ученые пытались определить повреждение в ходе онкологических исследований по количеству метилцитозина. И только после того, как научились читать 5-ю букву из набора генетической информации (А Ц Т Г и метилцитозин), стало понятно в какую сторону двигаться?
Совершенно верно. Для понимания того, в какую сторону неправильно изменяется общий характер метилирования ДНК в злокачественных опухолях, необходимо вспомнить как выглядит ландшафт метилирования ДНК нормального генома.
Наш геном состоит из тех генов, которые нам нужны, примерно на 1,5%. Больше 95% генетического материала, который родители передают детям, а клетки в результате деления передают друг другу лет 20-30 назад называли «генетическим мусором». В этом вопросе мы невыгодно отличаемся от простейших организмов, например, бактерий или вирусов, у которых весь геном состоит только из нужных им генов. У человека большая часть генома представлена инородными включениями, накопившимися за миллионы лет эволюции. В частности, вирусными включениями. Встроенные в геном человека остатки вирусов и части нашего собственного генома, которые внезапно начали активно размножаться и распространяться по геному, являются потенциально опасными. Предназначение вирусного генома – встраивание в геном хозяина и размножение в клетке, что приводит к нарушению стабильности генома. Нормальная структура генома человека может начать разрушаться, а нестабильный геном характерен для опухолевой клетки.
Для того, чтобы этого не происходило, чтобы все «инородные сущности молчали», а их гены не работали, применяется простой механизм – метилирование чужеродных генов. Поэтому большая часть нашего генома, которая «не наша», в норме - метилирована.
Характеристика опухолевого генома и эпигенома заключается в том, что наступает тотальное деметилирование, которое приводит к деактивации «спящих агентов», далее – к их размножению, встраиванию в новые места генома. Результат - нестабильность генома, что равно геному опухолевой клетки. Подобный процесс происходит в любой злокачественной клетке и является ее маркером.
Если провести количественное определение метилирования ДНК, то в опухолевой клетке метилирования ДНК окажется намного меньше, что является маркером рака. Однако это неспецифическое явление, и как его использовать в диагностике пока не очень понятно. С другой стороны, у нас есть и наши собственные гены, которые составляют 1,5% генома. Они важны тем, что организм их постоянно «включает» и «выключает» в зависимости от собственных потребностей. «Включенные» гены имеют неметилированные регуляторные участки. В частности, среди генов человека значительную долю занимают не те, которые строят структуру организма и которые обеспечивают биохимические реакции, а те, которые регулируют интенсивность клеточного деления. Существуют гены-супрессоры опухолевого роста, которые подавляют рост опухолей, и они должны работать всегда. В случае аномального метилирования они «выключатся», и клеточный цикл выйдет из-под контроля. Это второе свойство опухолевой клетки – бесконтрольное деление.
Гены, подавляющие опухолевый рост, аномально метилированы в опухоли. Инородные агенты в опухолевых клетках активируются, а гены, которые контролируют клеточный рост, инактивируются за счет метилирования ДНК.
Среди событий аномального «выключения» регулирующих генов можно найти такие, которые окажутся более специфичными для отдельных подтипов опухолей, которые могут маркировать более агрессивные или менее агрессивные опухоли, а также более или менее чувствительные к лекарственным препаратам. В настоящее время существует не так много лабораторных тестов, которые нацелены на определение аномального метилирования генов-супрессоров опухолевого роста. Существует несколько классических примеров, которым уже более 10 лет: противоопухолевый препарат Темозоломид – алкилирующий агент, клеточный яд. Механизм его действия – внесение повреждений в молекулу ДНК. При повышении дозы количество повреждений доводится до того уровня, когда клетка уже не может нормально поделиться. Такая клетка, как минимум, не оставляет потомства, а как максимум, погибает. Идеальный вариант – воздействовать таким ядом прицельно на опухолевые клетки, не затрагивая здоровые клетки организма. Однако при назначении лекарственного препарата, в большинстве случаев невозможно предвидеть как он будет действовать на опухолевые клетки. Аналогичным образом препарат может действовать и на нормальные клетки. Отсюда побочные эффекты большинства химиотерапевтических препаратов. Те повреждения, которые вносит Темозоломид, исправляются природным ферментом – метилгуанин-ДНК-метилтрансферазой (MGMT). Чем активнее работает MGMT, даже при повышении дозы Темозоломида, тем быстрее осуществляться репарация ДНК.
Правильно ли я понимаю, что этот фермент воздействует и на здоровую, и на раковую клетки?
Совершенно верно. Оказалось, что в некоторых опухолях за счет разбалансировки эпигенетических механизмов происходит аномальное метилирование гена этого фермента, и там он не работает. Опухоли, в которых «выключен» фермент репарации ДНК - MGMT, оказываются более чувствительными к воздействию Темозоломида, чем остальные клетки организма. Именно таким пациентам, у которых метилирован MGMT в опухоли, действие Темозоломида становится избирательным. Можно выбрать терапевтическое окно, в котором MGMT еще некатастрофично нарушает работу всех других клеток, но катастрофично нарушает работу генома опухоли.
То есть этот яд можно разбавить, снизить его концентрацию, он будет убивать именно раковые клетки?
Да. Для того, чтобы определить, будет ли опухоль чувствительна, достаточно взять материал опухоли и провести не очень дорогой и не очень сложный генетический анализ – анализ метилирования ДНК гена MGMT. Если аномальное метилирование присутствует, можно говорить о том, что опухоль будет чувствительна к этому препарату.
Получается, что как только была выявлена эта связь, был открыт подход к терапии?
Да. Это выяснили около 25-ти лет назад, и сегодня эти знания используются в клинической практике. Дополнительно выяснилось, что метилированное состояние MGMT ассоциировано с определенным прогнозом выживаемости у пациентов, что позволяет врачу корректировать подход к терапии пациентов с некоторыми видами опухолей. Речь идет, в основном, о глиобластомах – злокачественных опухолях головного мозга, которые очень плохо лечатся. Сегодня человечество неуклонно приближается к тому, чтобы, перебирая множество вариантов, находить слабые места заболеваний и поражать их.
А этот перебор, насколько он случаен и насколько адресен? Ведь это может быть даже несколько десятков тысяч кодов, комбинаций, как спланировать такое исследование? Как догадаться хотя бы о направлении движения?
Мне очень нравится вариант «пойди туда, не знаю куда». Это то, что называется непредвзятым подходом к поиску цели, не основанным на какой-либо априорной гипотезе, где мы ищем «под фонарем». Сейчас в геномную и постгеномную эру именно такой подход с возможностью проанализировать огромный объем данных дает много неожиданных и интересных результатов. Еще 20-30 лет назад были результаты, основанные только на знании законов биологии, и каждая находка вызревала десятилетиями. Сегодня технические и научные возможности позволяют открыть множество кандидатных генов, на которые было бы полезно воздействовать, планируя лечение опухоли.
Как грамотно планировать исследование?
Прежде всего, нужны знания в области биомедицины. Метилом – это совокупность показателей метилирования ДНК по всему геному. Далее следует сравнить метилом опухоли с метиломом нормы или метиломом опухоли, которая хорошо отвечает на лечение, с метиломом опухоли, которая плохо отвечает на лечение. Находим так называемые дифференциально метилированные участки, т.е. те места генома, которые по-разному метилированы в сравниваемых группах. Нам важно узнать, влияет ли метилирование на функцию генов. В учебниках написано: есть метилирование – ген не работает, нет метилирования – ген работает. Этот постулат не всегда прост и однозначен, поэтому необходимо обращаться к транскриптомам (анализу экспрессии генов). Это показывает, что ген метилирован и действительно не работает. Более приятная ситуация – обратная, когда в опухоли «включается» какой-то ген, который не работает больше нигде. С его «включением» появляется эктопически экспрессированный белок (появляющийся «не вовремя и не там»». Если опухоль отличается экспрессией именно этого белка от всех остальных клеток организма, деятельность этого белка можно подавить. В этом случае опухоль может прекратить свое развитие, что является позитивным результатом лечения.
В настоящее время при лечении онкозаболеваний «включить» что-то полезное очень сложно. Но можно «выключить» что-то вредное, подавляя работу рецепторов клеточной поверхности, а также молекул, которые передают сигналы клетки, обманывая ее и заставляя быстрее делиться, создавая опухоль. Гораздо проще что-нибудь «выключить» из того, что аномально «включилось». Если найти дифференциально метилированный ген и доказать, что он включается аномально в опухоли определенного типа, можно из библиотеки веществ, из неограниченного сегодня набора химических и биохимических соединений, подобрать такие, которые потенциально этот ген могут ингибировать. После этого начинаются доклинические и клинические испытания сначала на модельных опухолевых клетках, затем на модельных животных, далее на опухолевых клетках человека. Через 20-30 лет появится способ лечения с использованием конкретного лекарственного препарата.
Потрясающе получается: сначала мы играем в игру «найди 5-10 отличий», потом определяем, какое отличие «включает – выключает» ту самую злокачественную характеристику в опухоли, потом учимся ее «выключать», потом действуем определенным веществом. Это колоссальная работа. Скажите, пожалуйста, когда вы говорите, что вам помогают компьютерные математические машины, насколько серьезно на работу влияют технологии ускорения, повышения производительности труда генных инженеров, которые исследуют эти участки? Я не понимаю, как это можно сделать без высокопроизводительных компьютеров.
Никак нельзя. Термин «генный инженер» уже не так часто используется, но суть осталась. Есть специалисты, которые создают конструкции редактирования генома. Эти работы ведутся и в Медико-генетическом научном центре имени академика Н.П. Бочкова. Это действительно инженерная работа: необходимо спланировать и спроектировать конструкцию. Работы по редактированию генома начались не так давно. Пока они ведутся штучным образом, когда на каждый участок генома, который мы хотим отредактировать, нужно спроектировать конструкцию, которая разломает поврежденный участок генома, а потом его восстановит, т.е. отремонтирует так, чтобы в конечном итоге клетка стала здоровой. Процесс переходит в область генотерапии, т.е. лечения генетических заболеваний. Таким образом, генные инженеры – это передовой край молекулярной генетики.
Если мы говорим о ваших исследованиях, то какие могут быть практические примеры, где это используется в практике? Дошло ли уже дело до применения их в терапии современных заболеваний? Ждать ли результатов через 30 лет? Может быть, что-то уже появилось или скоро появится?
Классическая работа, которая проводится в МГНЦ - применение маркеров метилирования на примере Темозоломида и MGMT. С помощью широкогеномных скринингов мы сосредоточились на проблеме предсказания эффекта неоадъювантной химиотерапии (предоперационной химиотерапии) рака молочной железы. Когда пациентка попадает в лечебное учреждение онкологического профиля с диагнозом рак молочной железы, одним из лучших способов лечения злокачественного новообразования до сих пор остается хирургическое лечение. Но перед тем, как проводить хирургическую операцию, при некоторых типах рака молочной железы назначается предоперационная химиотерапия. Ее цель – уменьшение объема опухоли, которая станет более операбельной, и выявление чувствительности опухоли к определенным препаратам. Если опухоль была чувствительна к препаратам до операции, то остатки опухоли после операции тоже могут быть чувствительны к этому веществу и можно продолжать его назначение. Однако неоадъювантная химиотерапия может быть эффективна далеко не при всех формах рака молочной железы. Многие пациентки не достигают позитивного эффекта от предоперационного лечения, и опухоль может продолжить развиваться, увеличиваться и распространяться. Очень важно врачам знать заранее эффективность неоадъювантной химиотерапии, которую сейчас по клиническим рекомендациям прописывают всем женщинам с конкретным типом рака молочной железы. Эффективных маркеров (лабораторных, клинических, морфологических), которые предсказывали бы эффективность неоадъювантной химиотерапии, не существует. Есть некоторые признаки, которые с не очень высокой степенью диагностической эффективности могут предсказать, что в каком-то случае будет более или менее эффективное лечение. В распоряжении нашей лаборатории оказалась коллекция биопсий опухолей молочной железы, полученных до и после проведения неоадъювантной химиотерапии. Биоптат берется для определения с помощью микроскопического исследования подтипа опухоли, а также для назначения схемы химиотерапии. После хирургического вмешательства берется повторно образец биопсии опухоли для определения эффективности проведенной химиотерапии. В результате проведения нескольких циклов химиотерапии, ее эффективность оценивается по ряду морфологических признаков. Важным признаком является безрецидивная выживаемость, т.е. период жизни пациентки без рецидива злокачественной опухоли.
Для того, чтобы лечить рак молочной железы, у женщин используется определенная неоадъювантная химиотерапия. Не всем она помогает. В своей работе вы пытались выявить пациенток, на которых не действует химиотерапия? Какое их количество с точки зрения нашего населения?
Доля отвечающих и не отвечающих на преоперационную химиотерапию зависит от подтипа рака молочной железы. Существует, как минимум, четыре молекулярных подтипа рака молочной железы. Это совершенно разные опухоли, объединенные только локализацией в одном и том же органе. С точки зрения процессов опухолеобразования, общебиологических основ и чувствительности к лечению они совершенно разные и не одинаково чувствительны к химиотерапии. Эффективность и доля пациенток, для которых эта химиотерапия будет неэффективной, может составлять несколько десятков процентов.
Вернемся к проблеме поиска маркеров, когда от вас требуется заключение по эффективности или неэффективности назначаемой химиотерапии. Что это значит для врача?
Если мы предскажем, что назначенное лечение будет неэффективно и его лучше отменить, несколько месяцев неоадъювантной химиотерапии подвергнут пациентку серьезному токсическому воздействию, при этом откладывается хирургическое вмешательство. При этом, положительный результат не достигается, и ухудшается состояние пациентки. Существуют клинические рекомендации по применению тех или иных препаратов и схем лечения. Изменение клинических рекомендаций – тяжелый процесс, который должен быть основан на доказательной медицине, т.е. на доказательствах, полученных многими независимыми исследователями, исследовательскими и клиническими группами. На сегодняшний день наша лаборатория является единственной группой, которая предлагает набор эпигенетических маркеров для определения эффективности неоадъювантной химиотерапии. Когда предлагаемый нами способ будет внедрен в клиническую практику, и когда пациенты получат пользу от этого знания? Думаю, что до этого еще очень далеко. На сегодняшний день мы полностью завершили этот проект. Мы определили маркеры, разработали простые способы для их обнаружения в любой клинико-диагностической лаборатории, опубликовали ряд статей в уважаемых рецензируемых журналах. Эти исследования должны привлечь внимание многих ученых, результаты цитироваться и обсуждаться. В настоящее время проект оценивается экспертным сообществом, только после этого можно будет говорить о возможности доклинических испытаний этих технологий. Перспектива – не ближайшая.
С одной стороны, мы говорим о том, что исследование проводится в федеральном институте. Это фундаментальное исследование и, фактически, готовая технология. Но ее внедрение зависит от мнения многих. А государство заинтересовано в использовании представленных методов, если метод и технология уже есть? Может быть, следует выделить группу клиник, которые будут набирать статистику, ведь это социально значимое исследование?
И все равно этому этапу должен предшествовать период ознакомления и привыкания. На сегодняшний день врач полностью защищен в своих действиях от личных соображений, как лучше пациенту помогать. Врач должен действовать строго в рамках клинических рекомендаций. Если для каких-то нозологий еще нет клинических рекомендаций, врачи инициируют их выпуск, чтобы избежать претензий от пациентов в случаях применения новых неопробованных технологий, что может привести к судебному процессу. Необходима дальнейшая научно-исследовательская программа и программа по внедрению разработанных технологий. Само исследование у нас заняло около 10-ти лет и было поддержано Российским научным фондом и Государственным заданием от Министерства науки и высшего образования РФ. На сегодняшний день существуют способы перевода научно-исследовательских работ в опытно-конструкторские, поэтому процесс будет продолжаться и развиваться.
О перспективах. Куда дальше вы планируете двигаться со своим коллективом, который приобрел за годы работы уникальные опыт и знания?
Фокус наших работ – фундаментальные исследования. Среди тех маркеров метилирования, которые мы обнаружили и проанализировали, найдены определенные биологические закономерности, которые в будущем могут быть внедрены в практику. Сейчас это новые соображения из области биологии опухоли. Пока у нас нет текущего проекта по внедрению нашей диагностической системы, у нас возникли фундаментальные находки, которые требуют дальнейшего изучения.
Я уверен, что еще не на одно поколение хватит замечательных открытий в области медицинской биологии.