Актуальные вопросы секвенирования нового поколения обсудили ведущие эксперты на конференции "NGS в медицинской генетике"

Конференция «NGS в медицинской генетике 2024» посвящена современным возможностям диагностики наследственной патологии. Эксперты рассмотрели актуальные вопросы биоинформатического анализа и клинической интерпретации данных.

Технология секвенирования нового поколения открыла новые возможности в диагностике наследственных заболеваний: не только существенно сократила сроки постановки редкого диагноза, но также позволила все чаще открывать ранее не описанные генетические варианты.

Организатор конференции — ФГБНУ «Медико-генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова».

Антисмысловая персонифицированная терапия

Идее использовать антисмысловые молекулы (АМ) как инструмент генетической терапии уже более 45 лет, а большинство одобренных генетических препаратов являются именно антисмысловыми олигонуклеотидами.

Наиболее яркий пример персонифицированной антисмысловой терапии -  препарат Milasen. В 2016 году пациенту был поставлен клинический диагноз болезнь Баттена, но был найден лишь один патогенный вариант в гене, отвечающем за развитие данной болезни.  Для развития болезни Баттена необходимо по одному патогенному варианту на каждой хромосоме, поэтому для поиска второго варианта было инициировано научное исследование, которое в дальнейшем перевернуло взгляды всего мира на применение АМ в генетической терапии.

Вначале в результате полногеномного секвенирования исследователи обнаружили инсерцию мобильного генетического элемента, приводящую к нарушению сплайсинга и преждевременной терминации транскрипции гена. Далее ученые направили различные АМ на функциональные участки данной инсерции и нашли наиболее эффективную, которая приводила к восстановлению экспрессии гена. На основе этой последовательности был синтезирован препарат Milasen. Препарат оказал положительный эффект на состояние пациента и позволил значительно замедлить стремительный прогресс заболевания.  От начала научного исследования по поиску второго патогенного варианта до одобрения препарата прошло  менее года, поэтому этот пример по праву стал началом эры персонифицированной антисмысловой терапии. Она предназначена для лечения пациентов с ультраредкими заболеваниями (1–30 пациентов в мире), а для поддержки ее разработки в мире создано несколько фондов (https://www.nlorem.org/).

В лаборатории наследственных болезней обмена веществ (НБО) Медико-генетического научного центра имени академика Н.П. Бочкова исследователи разрабатывают современные подходы к доставке антисмысловых молекул, которые заключаются в использовании вирусных частиц. Данные подходы позволяют решить одну из основных проблем – низкую биодоступность антисмысловых молекул для большинства тканей и органов.

«Для доставки антисмысловых молекул при помощи вирусных частиц есть несколько систем. Первая – это экспрессия антисмысловой молекулы в составе U7 рибонуклеопротеина. Это комплекс малой РНК и белков, в котором мы заменяем небольшой участок РНК на антисмысловую последовательность и направляем U7 на блокирование различных мотивов на пре-мРНК. Вторая система – это U1 рибонуклеопротеин, который в норме участвует в распознавании донорного сайта сплайсина. Мы также можем заменить его небольшой фрагмент на антисмысловую последовательность к интересующему нас экзону и улучшить его распознавание. Третья система заключается в том, что при помощи специальных рибозимов мы можем придать антисмысловой РНК кольцевую замкнутую структуру, значительно увеличив её стабильность, и также направить на блокирование мотивов на пре-МРНК. Именно эти системы, по моему мнению, являются наиболее актуальными», - рассказал старший научный сотрудник лаборатории НБО, к.м.н. Игорь Бычков.

В лаборатории НБО активно проводятся эксперименты по тестированию антисмысловых молекул для потенциальной терапии лизосомных болезней накопления, в частности, мукополисахаридозов IV А, IV B и VI типов, а также дефицита лизосомной кислой липазы.

К примеру, при дефиците лизосомной кислой липазы исследователям необходимо было усилить распознавание экзона, ослабленного мутацией сплайсинга, которая встречается более чем у 80% пациентов. Для этой цели были протестированы различные антисмысловые молекулы в составе U1 рибонуклеопротеина, и на основе наиболее эффективной молекулы были собраны лентивирусые частицы, и проведена трансдукция фибробластов пациента.

«Это привело к полному восстановлению нарушенного сплайсинга. Поиск наиболее эффективной антисмысловой последовательности является первым этапом в разработке персонифицированной антисмысловой терапии. Эта работа на данный момент продолжается, и мы планируем далее провести оценку специфичности U1 анализом транскриптома фибробласта и надеемся перейти на преклинические испытания на модельных животных», - отметил Игорь Бычков.

OncoNGS

Основной вопрос, которому были посвящены практически все доклады секции «OncoNGS»  — особенности применения критериев патогенности генетических вариантов в онкологии и оценка предиктивной клинической значимости соматических мутаций. До сих пор ни в российской онкогенетике, ни за рубежом нет единого консенсуса по категоризации соматических вариантов, а ведь именно тестирование соматических мутаций  является самым востребованным генетическим анализом у онкологических больных, поскольку их результаты позволяют назначить таргетную терапию. Сегодня большинство лабораторий для категоризации соматических мутаций в онкологии пользуются в работе критериями Американского общества патологов (АМР) 2017 г., аналогичные Европейские критерии ESCAT от 2018 г. используются реже — они не применимы для маркеров резистентности, и во главу угла в них ставят статус клинических испытаний в ущерб другим оценочным факторам. Критерии Российского общества клинической онкологии (RUSSCO), изданные и переработанные в 2020-х гг., также не часто применяют в практике — строго говоря, они не являются консенсусом всех ключевых отечественных лабораторий, например, членов Межрегионального объединения молекулярных генетиков в области онкологии и онкогематологии. В них введен дополнительный уровень значимости, и есть ряд спорных вопросов по формулировкам критериев. Консенсус 2022 г. по онкогенности соматических вариантов ведущих мировых профессиональных обществ позволяет оценить мутацию как драйвер канцерогенеза, но не как показание к назначению препарата, а многочисленные международные базы данных о соматических мутациях в опухолях (COSMIC, CancerHotSpots, MyCancerGenome и другие) — это лишь отдельные инструменты в работе врача-лабораторного генетика, но не четкие критерии для формирования результативной части заключения. Поэтому зачастую производители мультигенных панелей разрабатывают собственное программное обеспечение, которое позволяет пользователям в своих аккаунтах анализировать данные секвенирования соответствующих NGS-панелей и аннотировать соматические варианты с учетом критериев АМР 2017 и современного их статуса как биомаркеров в мире и в России.

«Со стороны кафедры онкогенетики ИВиДПО предлагается подход к формированию заключения, когда в основной таблице указывают статус мутации по АМР 2017, другую необходимую информацию о выявленном соматическом варианте, а также дополнительную характеристику — наличие/отсутствие препарата, который может быть назначен в связи с обнаружением данной мутации, в Государственном реестре лекарственных средств (ГРЛС) Минздрава России. Это позволило бы врачам сразу соотносить класс мутации по АМР 2017 с реальностью получения соответствующего таргетного препарата непосредственно в России в формате утвержденных схем лечения, клинических испытаний или как офф-лейбл по решению регионального онкологического консилиума», - рассказал заведующий кафедрой онкогенетики ИВиДПО МГНЦ, к.м.н, доцент Дмитрий Михайленко.

Предполагается, что решение о способе аннотации генетических вариантов в опухолях и оптимальной форме заключения будет принято позднее в ходе консультаций с ведущими лабораториями, осуществляющими в России молекулярно-генетическую диагностику онкологических заболеваний.

NGS и частые из редких болезней

В ряде случаев секвенирование нового поколения необходимо для постановки частых среди редких диагнозов моногенных заболеваний, например, фенилкетонурии. Ежегодно в России рождается от 250 до 300 детей с этим заболеванием. За него ответственны патогенные варианты в гене PAH. Для их выявления сначала проводится анализ на частые мутации в этом гене. Однако, если в кодирующих участках гена мутация не была выявлена, необходимо расширять поиск: исследовать некодирующие  и регуляторные участки, искать варианты перестроек, при которых экзонная последовательность остается нормальной, но оказывается перевернутой. Цитогенетические методы не всегда позволяют выявлять такие варианты, их можно увидеть с помощью панели высокопроизводительного секвенирования, включающей интроны.

«Панельное высокопроизводительное секвенирование – лучший метод обследования в рамках массового скрининга новорожденных, после поиска частых мутаций. Панель обладает высокой производительностью и информативностью, ее себестоимость сравнима с себестоимостью секвенирования по Сенгеру одного большого гена. Кроме того, результаты можно получить в короткие сроки и быстро проанализировать результаты», - заявила заведующая лабораторией молекулярно-генетической диагностики №1 МГНЦ, д.м.н. Ольга Щагина.

Выявление обеих мутаций при фенилкетонурии и  других рецессивных заболеваниях важно не только для последующего медико-генетического консультирования семьи, но и для подбора терапии, поскольку препараты, как правило, назначаются в зависимости от генотипа конкретного пациента.

Круглый стол «Рекомендации по интерпретации данных NGS»

На круглом столе обсуждались недавно опубликованные рекомендации по интерпретации и анализу данных секвенирования следующего поколения в пренатальный период, поднимался вопрос о необходимости разработки рекомендаций по интерпретации вариантов в генах, обуславливающих группы патологий на примере кардиогенетики, а также актуализации основных действующих в РФ руководств по интерпретации данных секвенирования следующего поколения.

Заведующая ЦКП «Геном» МГНЦ, к.м.н. Оксана Рыжкова отметила, что прошло 5 лет с момента выхода второй версии руководств по интерпретации данных, полученных методом NGS.  Часть положений за это время устарела, другая часть требует переосмысления и поправок. Участники круглого стола обсудили возможную корректировку документа с учетом актуальных рекомендаций ASHG, ESHG и других.

В частности, было предложено дополнить критериями анализа вариантов митохондриальной ДНК, расширить список «вторичных» находок, а также отказаться от практики подтверждения вариантов, выявленных методом NGS, альтернативными методами (секвенирование по Сенгеру), если исследование выполнено с надлежащим качеством. Стандарты качества еще обсуждаются в профессиональном сообществе, ожидается, что они будут приняты уже в этом году.

«Отказ от подтверждения, выявленного на NGS варианта методом секвенирования по Сенгеру позволит снизить затраты на исследования, а также существенно сократить сроки окончательной постановки диагноза в части случаев. Сегодня ожидание подтверждения вариантов, выявленных методом NGS альтернативными методами может занять до полугода», - отметила Оксана Рыжкова. 

Подробнее: https://medcoinfo.ru/mgngs24/